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收稿日期: 2008212220   基金項目: 四川大學985項目資助
作者簡介:唐成康(1976~) ,男,博士研究生,研究方向:蛋白質化學和蛋白質工程研究
3 通訊作者Corresponding author
動物源雜合肽P18對白血病K562細胞的致死作用研究
唐成康, 趙曉軍
3
(四川大學納米生物醫學技術與膜生物學研究所, 成都610041)
摘要:通過其致死白血病K562細胞過程,對動物源雜合肽P18的分子結構與功能進行了研究。MTT實驗表明
P18顯著致死K562細胞;Western blot實驗和流式細胞分析提示P18導致K562細胞壞死,而非依賴于caspases的傳
統凋亡;熒光探針標記后,觀察到P18顯著增加K562細胞的膜通透性;圓二(CD)圖譜分析,在模擬細胞膜環境的溶
液中, P18分子出現α2螺旋。綜上所述, P18肽分子可能在細胞膜微環境的介導下產生α2螺旋,產生或暴露了肽分
子的破膜結構,導致膜通透性顯著增加,最終導致K562細胞的壞死。
關鍵詞: 肽P18; 凋亡; 壞死; 質膜; 通透性; 二級結構
中圖分類號:Q291; R979. 1  文獻標識碼:A  文章編號: 1000 - 7083 (2009) 03 - 0324 - 05
Effect of An ima l Ba sed Hybr id Peptide P18 in Human Leukem ia K562 CellDea th
TANG Cheng2kang, ZHAO Xiao2jun
3
( Institute forNanobiomedical Technology andMembrane Biology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)
Abstract: The structure and function of animal based hybrid pep tide P18 in human leukemia K562 cell death was stud2
ied. MTT data showed that P18 had significant anticancer activities against leukemia K562 cells. Western blot and flow cy2
tometry assay indicated that P18 caused K562 cell necrosis rather than the classical apop tosis. K562 cells treated with P18
were observed to p rofoundly enhance their p lasma membrane permeability as visualized by a florescent p robe. Circular Di2
chroic (CD) spectroscopy measurements showed that P18 adop ted anα2helix structure in membrane2mimic solution. It is
possible that P18 molecules are induced by the membrane environment and form anα2helix structure, which might endow
P18 with ability to enhance the permeability of the p lasma membrane, disrup t the cellular physiological balance and trigger
the necrosis of K562 cells.
Key words: pep tide P18; apop tosis; necrosis; p lasma membrane; permeability; second structure
長期以來,癌癥的治療是人類面臨最大的醫學難題之一。最新統計顯示, 全世界癌癥患者超過2400萬,每年約有700 萬患者死于癌癥,約占全世界死亡人數的12. 5%。一直以來,抗癌藥物的研發始終是世界關注的熱點。在眾多抗癌藥物的研發過程中,研究者發現在某些生物,特別在動物的免疫系統中發揮重要作用的短肽分子展示出了較強的抗癌活性和較低的毒副作用( Cruciani et al. , 1991;Zasloff, 1992; Boman, 1995; Baker et al. , 1999;Hancock & Chapp le, 1999) ,抗癌短肽近年來逐漸作為潛在的抗癌藥物得到重視和深入研究。其中研究者在兩種源自動物的天然抗生素肽類分子天蠶素A( cecrop in A) ( Steiner et al. , 1981)和爪蟾素2 (ma2gainin2) (Zasloff, 1987)的分子序列基礎上,設計出了雜合肽分子P18 ( KWKLFKKIPKFLHLAKKF) ,研究表明P18分子具有顯著的抗癌活性和較低的毒副作用,是具有較高研發價值的抗癌分子( Shin et al. ,2001) ,但目前關于P18的研究沒有更深入的報道。本課題探索P18分子在導致白血病K562細胞死亡中的結構與功能研究,這將有助于P18肽分子在癌癥治療中的進一步開發利用,有益于新型抗癌肽類藥物的設計與開發。
1 材料與方法
1. 1 短肽P18的合成制備
委托上海波泰生物科技有限公司采用固相合成的方式合成短肽P18分子,首先通過多肽合成儀合成肽P18;然后選用HPLC色譜儀分析系統結合質譜分析確定目標肽;確定目標肽后,采用HPLC制備色譜儀進行肽P18制備;最后收集純化的短肽溶液,通過凍干制備得到所需肽制品,最后采用質譜進行分子鑒定, 合成報告表明短肽P18 的純度不低于95%。實驗中所用P18 溶液均用無菌去離子水配制。
1. 2 細胞株及細胞培養
白血病細胞K562及胚胎成纖維細胞N IH 3T3都采用RPM I 1640培養基( Invitrogen)進行培養,該培養基中配有抗生素( 100 units/mL penicillin G,100μg/mL strep tomycin)和10%的胎牛血清。兩株細胞都在37℃的含有5% CO2 的細胞培養箱中進行培養。
1. 3 MTT細胞毒性實驗
向96孔板中加入含有新鮮培養基的細胞懸濁液100μL,其中K562細胞懸液濃度為5 ×104 /mL,N IH 3T3細胞懸液濃度為1 ×105 /mL。37℃孵育24h之后,每孔分別添加10 μL 不同濃度的P18肽溶液或對照溶液(無菌去離子水) ,孵育48 h。然后向每孔添加20 μL MTT反應液( 5 mg/mL MTT溶于PBS, Sigma) , 37℃孵育4 h。之后立即加入100 μL含0. 01M HCl的10%的SDS溶液,過夜,用酶標儀于570 nm處測定吸收光度值A。依據對照組來確定細胞存活率,細胞存活率=A ( P18作用組) /A (對照組) ×100%。每組實驗均設置3個復孔。1. 4 Western blot檢測ca spa se 3的活化由于caspase 3蛋白涉及細胞凋亡途徑中的線粒體依賴途徑以及死亡受體介導途徑,發揮了關鍵的凋亡執行功能。為初步判斷短肽P18對K562的致死機理是否和細胞凋亡相關,我們選擇檢測P18作用下, K562細胞中caspase 3蛋白的活化情況。實驗中,將K562 細胞以5 ×104 /mL 的密度, 4 mL /孔
的體積接入六孔板培養, 24 h后分別加入400 μL /孔的P18肽溶液(終濃度15μM)或對照溶液(無菌去離子水,下同) ;孵育48 h后,收集細胞并提取蛋白,通過Western blot檢測P18作用下K562細胞中caspase 3蛋白的活化情況。
1. 5 流式細胞技術測定
為驗證短肽P18對K562的毒性和K562細胞死亡方式的初步判斷,采用Vybrant Apop tosis Assay試劑盒#7 (Molecular Probes)進行流式細胞分析(其中綠色熒光染料YO2PRO21可以染早期凋亡細胞和壞死細胞,而紅色熒光染料P I可以進入壞死細胞產生紅色熒光) 。在六孔板上每孔接種5 ×104 /mL的K562細胞懸液4 mL。37℃孵育24 h,分別加入終濃度為20μM的P18肽溶液或對照溶液,繼續孵育1h后收獲K562細胞,沖洗、混懸于pH7. 4的冷PBS溶液中。YO2PRO21和P I染色30 min后,通過流式細胞儀( FACSAria, BD ) 來分析存活( YO2PRO21-P I- ) 、凋亡( YO2PRO21+ P I- )或壞死( YO2PRO21+P I+ )的K562細胞比例。1. 6 P18分子對白血病K562細胞膜通透性的影響為了確定P18對白血病K562細胞的細胞毒性,以及觀測P18 對K562 細胞膜通透性的影響,采用L IVE /DEAD Viability/Cytotoxicity試劑盒中的兩種熒光染料———熒光探針鈣黃綠素calcein AM和溴乙非啶同源二聚體( EthD21)來開展相應實驗。活細胞普遍含有細胞內酯酶,該酶可以使進入細胞的calce2in AM染料發生轉化,產生非常均衡的綠色熒光;而EthD21不能進入細胞膜完整的活細胞,但可以通過已破損的胞膜進入死亡的細胞,通過與核酸的結合,在死亡的細胞中產生非常明亮的紅色熒光( Pap2adopoulos et al. , 1994) 。所以我們可以通過熒光倒置顯微鏡來觀察P18或對照溶液作用K562細胞后,細胞存活狀態以及細胞膜的通透性變化。實驗中,在6孔板上每孔接種5 ×104 /mL的K562細胞懸液4 mL, 37℃孵育24 h之后,分別加入終濃度為20μM的P18肽溶液或對照溶液繼續孵育, 12 h后收獲細胞,沖洗、混懸于pH7. 4 的PBS溶液中。經calceinAM和EthD21在室溫下避光染色40 min之后,置于
倒置熒光顯微鏡下觀察。
1. 7 P18分子的圓二( CD )圖譜分析
測定和比較了P18分子在極性水溶液以及在細胞膜模擬環境中的二級結構之間的變化。實驗采用了兩種模擬細胞膜環境的溶液: 50% (V /V)的TFE溶液(Roccatano et a l. , 2002)和30 mM的SDS溶液(Neidigh &Andersen, 2002) 。分別將P18溶于極性水溶液和上述模擬細胞膜環境的溶液中,使P18溶液的濃度達到200μM。4℃過夜,次日在37℃條件下,采用1 m徑的樣品池,在190~260 nm的掃描波長范圍內進行P18溶液的CD 掃描,每個樣品掃描3次,采用平均數作為掃描數據結果,最后將描數據轉換為摩爾橢圓率,通過比較各樣品的CD圖譜,分析P18分子在極性水溶液以及在細胞膜模擬環境中的二級結構之間的變化。
1. 8 統計方法
MTT實驗數據采用均數±標準差形式表示,組間比較采用t檢驗,使用SPSS 13. 0統計軟件分析。
5 2 3
四川動物2009年第28卷第3期                 S ichuan Journa l of Zoology Vol128 No13 2009
 

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