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                                                    多肽化學合成概述

1963年,R.B.Merrifield[1]創立了將氨基酸的C末端固定在不溶性樹脂上,然后在此樹脂上依次縮合氨基酸,延長肽鏈、合成蛋白質的固相合成法,在固相法中,每步反應后只需簡單地洗滌樹脂,便可達到純化目的.克服了經典液相合成法中的每一步產物都需純化的困難,為自動化合成肽奠定了基礎.為此,Merrifield獲得1984年諾貝爾化學獎.
今天,固相法得到了很大發展.除了Merrifield所建立的Boc法(Boc:叔丁氧羰基)之外,又發展了Fmoc固相法(Fmoc:9-芴甲氧羰基).以這兩種方法為基礎的各種肽自動合成儀也相繼出現和發展,并仍在不斷得到改造和完善.
Merrifield所建立的Boc合成法[2]是采用TFA(三氟乙酸)可脫除的Boc為α-氨基保護基,側鏈保護采用芐醇類.合成時將一個Boc-氨基酸衍生物共價交聯到樹脂上,用TFA脫除Boc,用三乙胺中和游離的氨基末端,然后通過Dcc活化、耦聯下一個氨基酸,最終脫保護多采用HF法或TFMSA(三氟甲磺酸)法.用Boc法已成功地合成了許多生物大分子,如活性酶、生長因子、人工蛋白等.
多肽是涉及生物體內各種細胞功能的生物活性物質。它是分子結構介于氨基酸和蛋白質之間的一類化合物,由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結合而成。到現在,人們已發現和分離出一百多種存在于人體的肽,對于多肽的研究和利用,出現了一個空前的繁榮景象。多肽的全合成不僅具有很重要的理論意義,而且具有重要的應用價值。通過多肽全合成可以驗證一個新的多肽的結構;設計新的多肽,用于研究結構與功能的關系;為多肽生物合成反應機制提供重要信息;建立模型酶以及合成新的多肽藥物等。

多肽的化學合成技術無論是液相法還是固相法都已成熟。近幾十年來,固相法合成多肽更以其省時、省力、省料、便于計算機控制、便于普及推廣的突出優勢而成為肽合成的常規方法并擴展到核苷酸合成等其它有機物領域。本文概述了固相合成的基本原理、實驗過程,對其現狀進行分析并展望了今后的發展趨勢。
從1963年Merrifield發展成功了固相多肽合成方法以來,經過不斷的改進和完善,到今天固相法已成為多肽和蛋白質合成中的一個常用技術,表現出了經典液相合成法無法比擬的優點。其基本原理是:先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價鍵的結構同一個不溶性的高分子樹脂相連,然后以此結合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經過脫去氨基保護基并同過量的活化羧基組分反應,接長肽鏈。重復(縮合→洗滌→去保護→中和及洗滌→下一輪縮合)操作,達到所要合成的肽鏈長度,最后將肽鏈從樹脂上裂解下來,經過純化等處理,即得所要的多肽。其中α-氨基用BOC(叔丁氧羰基)保護的稱為BOC固相合成法,α-氨基用FMOC(9-芴甲氧羰基)保護的稱為FMOC固相合成法,
2.固相合成的基本原理
多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程,固相合成順序一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的稱為液相合成法。現在多采用固相合成法,從而大大的減輕了每步產品提純的難度。為了防止副反應的發生,參加反應的氨基酸的側鏈都是保護的。羧基端是游離的,并且在反應之前必須活化。化學合成方法有兩種,即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多優勢,現在大多采用Fmoc法合成,如圖:
具體合成由下列幾個循環組成:
一、去保護:Fmoc保護的柱子和單體必須用一種堿性溶劑(piperidine)去除氨基的保護基團。
二、激活和交聯:下一個氨基酸的羧基被一種活化劑所活化。活化的單體與游離的氨基反應交聯,形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅使反應完成。循環:這兩步反應反復循環直到合成完成。
三、洗脫和脫保護:多肽從柱上洗脫下來,其保護基團被一種脫保護劑(TFA)洗脫和脫保護。
2.1 樹脂的選擇及氨基酸的固定
將固相合成與其他技術分開來的最主要的特征是固相載體,能用于多肽合成的固相載體必須滿足如下要求:必須包含反應位點(或反應基團),以使肽鏈連在這些位點上,并在以后除去;必須對合成過程中的物理和化學條件穩定;載體必須允許在不斷增長的肽鏈和試劑之間快速的、不受阻礙的接觸;另外,載體必須允許提供足夠的連接點,以使每單位體積的載體給出有用產量的肽,并且必須盡量減少被載體束縛的肽鏈之間的相互作用。用于固相法合成多肽的高分子載體主要有三類:聚苯乙烯-苯二乙烯交聯樹脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物,這些樹脂只有導入反應基團,才能直接連上(第一個)氨基酸。根據所導入反應基團的不同,又把這些樹脂及樹脂衍生物分為氯甲基樹脂、羧基樹脂、氨基樹脂或酰肼型樹脂。BOC合成法通常選擇氯甲基樹脂,如Merrifield樹脂;FMOC合成法通常選擇羧基樹脂如王氏樹脂。氨基酸的固定主要是通過保護氨基酸的羧基同樹脂的反應基團之間形成的共價鍵來實現的,形成共價鍵的方法有多種:氯甲基樹脂,通常先制得保護氨基酸的四甲銨鹽或鈉鹽、鉀鹽、銫鹽,然后在適當溫度下,直接同樹脂反應或在合適的有機溶劑如二氧六環、DMF或DMSO中反應;羧基樹脂,則通常加入適當的縮合劑如DCC或羧基二咪唑,使被保護氨基酸與樹脂形成共酯以完成氨基酸的固定;氨基樹脂或酰肼型樹脂,卻是加入適當的縮合劑如DCC后,通過保護氨基酸與樹脂之間形成的酰胺鍵來完成氨基酸的固定。
氨基、羧基、側鏈的保護及脫除
要成功合成具有特定的氨基酸順序的多肽,需要對暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護,同時對氨基酸側鏈上的活性基因也要保護,反應完成后再將保護基因除去。同液相合成一樣,固相合成中多采用烷氧羰基類型作為α氨基的保護基,因為這樣不易發生消旋。最早是用芐氧羰基,由于它需要較強的酸解條件才能脫除,所以后來改為叔丁氧羰基(BOC)保護,用TFA(三氟乙酸)脫保護,但不適用含有色氨酸等對酸不穩定的肽類的合成。1978年,chang Meienlofer和Atherton等人采用Carpino報道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作為α氨基保護基,Fmoc基對酸很穩定,但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫去,近年來,Fmoc合成法得到了廣泛的應用。羧基通常用形成酯基的方法進行保護。甲酯和乙酯是逐步合成中保護羧基的常用方法,可通過皂化除去或轉變為肼以便用于片斷組合;叔丁酯在酸性條件下除去;芐酯常用催化氫化除去。對于合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側鏈功能基的氨基酸的肽來說,為了避免由于側鏈功能團所帶來的副反應,一般也需要用適當的保護基將側鏈基團暫時保護起來。保護基的選擇既要保證側鏈基團不參與形成酰胺的反應,又要保證在肽合成過程中不受破壞,同時又要保證在最后肽鏈裂解時能被除去。如用三苯甲基保護半胱氨酸的S-,用酸或銀鹽、汞鹽除去;組氨酸的咪唑環用2,2,2-三氟-1-芐氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰基乙基保護,可通過催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛烷氧羰基(Adoc)保護,用冷的三氟乙酸脫去。
固相中的接肽反應原理與液相中的基本一致,將兩個相應的氨基被保護的及羧基被保護的氨基酸放在溶液內并不形成肽鍵,要形成酰胺鍵,經常用的手段是將羧基活化,變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強的失去劑(如碳二亞氨)形成對稱酸酐等方法來形成酰胺鍵。其中選用DCC、HOBT或HOBT/DCC的對稱酸酐法、活化酯法接肽應用最廣。
裂解及合成肽鏈的純化BOC法用TFA+HF裂解和脫側鏈保護基,FMOC法直接用TFA,有時根據條件不同,其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護方法也被采用。合成肽鏈進一步的精制、分離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細管電泳等。
4.固相合成的特點及存在的主要問題
固相合成法對于肽合成的顯著的優點:簡化并加速了多步驟的合成;因反應在一簡單反應器皿中便可進行,可避免因手工操作和物料重復轉移而產生的損失;固相載體共價相聯的肽鏈處于適宜的物理狀態,可通過快速的抽濾、洗滌未完成中間的純化,避免了液相肽合成中冗長的重結晶或分柱步驟,可避免中間體分離純化時大量的損失;使用過量反應物,迫使個別反應完全,以便最終產物得到高產率;增加溶劑化,減少中間的產物聚焦;固相載體上肽鏈和輕度交聯的聚合鏈緊密相混,彼此產生一種相互的溶劑效應,這對肽自聚集熱力學不利而對反應適宜。固相合成的主要存在問題是固相載體上中間體雜肽無法分離,這樣造成最終產物的純度不如液相合成物,必需通過可靠的分離手段純化。
5.固相合成的研究發展前景
固相多肽合成已經有40年的歷史了,然而到現在,人們還只能合成一些較短的肽鏈,更談不上隨心所欲地合成蛋白質了,同時合成中的試劑毒性,昂貴費用,副產物等一直都是令人頭痛的問題,而在生物體內,核糖體上合成肽鏈的速度和產率都是驚人的,那么,是否能從生物體合成蛋白質的原理上得到一些啟發,應用在固相多肽合成(樹脂)上,這是一個令人感興趣的問題,也許是今后多肽合成的發展。
在Boc合成法中,反復地用酸來脫保護,這種處理帶來了一些問題:如在肽與樹脂的接頭處,當每次用50%TFA脫Boc基時,有約1.4%的肽從樹脂上脫落,合成的肽越大,這樣的丟失越嚴重;此外,酸催化會引起側鏈的一些副反應.Boc合成法尤其不適于合成含有色氨酸等對酸不穩定的肽類.1978年,Chang、Meienlofer和Atherton等人采用Carpino[3]報道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)基團作為α-氨基保護基,成功地進行了多肽的Fmoc固相合成.Fmoc法與Boc法的根本區別在于采用了堿可脫除的Fmoc為α-氨基的保護基.側鏈的保護采用TFA可脫除的叔丁氧基等,樹脂采用90%TFA可切除的對烷氧芐醇型樹脂和1%TFA可切除的二烷氧芐醇型樹脂,最終的脫保護避免了強酸處理.

6. HPLC分析和純化
分析HPLC使用柱子和泵系統,可以經受傳遞高壓,這樣可以用極細的微粒(3-10μ m)做填料。由此多肽要在幾分鐘內高度被分析。
HPLC分兩類:離子交換和反相。 離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體,而多肽或多肽混合物,由其氨基酸組成表現出相反電荷。分離是一種電荷相互作用,通過可變PH, 離子強度, 或兩者洗脫出多肽,通常,先用低離子強度的溶液,以后逐漸加強或一步一步加強,直到多肽火柱中洗脫出。離子交換分離的一個例子使用強陽離子交換柱。如sulfoethylaspartimide通過酸性PH中帶正電來分離。
反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過疏水作用連到柱上,用降低離子強度洗脫,如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構成,這種鏈長度為G4-G8碳原子。由于洗脫是一種疏水作用。大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。 然而,總體實踐中, 這兩類柱互變無多少顯著差別,別類載體由碳水化合物構成, 比如苯基。
典型的操作常由兩綬沖劑組成,0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用徑向填柱,那么大小是8×100(3-10μ m)和25×250mm(10μ m)
大量各種緩沖劑含許多不同試劑,比如heptafluorobutyric酸,0.1%磷酸,稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸鈉/氨,TFA/TEA,磷酸鈉或鉀,異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑,但要注意一點:硅反相柱料不能長時間暴露于高pH,甚至微堿pH,因為這樣會破壞柱子。
7. Fmoc―氨基酸的制備和側鏈保護
Fmoc基團是在有NaHCO3或Na2CO3存在的二氧六環溶液中,通過以下反應引入到氨基酸中的:
理想的Fmoc-氨基酸的側鏈保護基應在堿性條件下穩定,在酸性條件下脫除.下面對其做一介紹.
7.1 Asp和Glu
Asp和Glu側鏈羧基常用t-Bu保護.可用TFA、TMSBr等脫除.但是用t-Bu保護仍有側鏈環化形成酰亞胺的副反應發生.近年來,發展了一些新的保護基如環烷醇酯、金剛烷醇酯等可減輕這一副反應,這些保護基可用TMSOTf(三氟甲磺酸三甲硅烷酯)除去.
7.2 Ser、Thr和Tyr
ser、Thr的羥基及Tyr的酚羥基通常用t-Bu保護.叔丁基的引入比較麻煩,首先ser制成芐氧羰基酯,再在酸催化下與異丁烯反應.Ser和Thr還可用芐基保護,Ser用芐醇引入芐基、Thr用溴芐引入芐基.
7.3 Asn和Gln
Asn和Gln側鏈的酰胺鍵在肽合成中一般不加以保護.但合成大肽時,Asn和Gln的α-羧基活化時可能會發生分子內脫氫反應生成氰基化合物.堿性時Gln的側鏈可以環化生成酰胺.而且不保護的Fmoc-Gln和Fmoc-Asn在DCM中溶解度很差.為了避免這些問題,可以用9-咕噸基,2,4,6-三甲氧芐基,4,4′―二甲氧二苯甲基或三苯甲基等保護,這四種基因均可用TFA脫除.
7.4 His
His是最容易發生消旋化的氨基酸,必須加以保護.
對咪唑環的非π-N開始用芐基(Bzl)和甲基磺酰基(TOS)保護.但這兩種保護基均不太理想.TOS對親核試劑不穩定,Bzl需要用氫解或Na/NHs除去,并且產生很大程度消旋.Boc基團是一個較理想的保護基,降低了咪唑環的堿性,抑制了消旋,成功地進行了一些合成.但是當反復地用堿處理時,也表現出一定的不穩定性.哌啶羰基在堿中穩定,但是沒能很好地抑制消旋,而且脫保護時要用很強的親核試劉如.
對咪唑環π-N保護,可以完全抑制消旋,π-N可以用芐氧甲基(Bom)和叔丁氧甲基(Bum)保護,(Bum)可以用TFA脫除,Bom更穩定些,需用催化氫解或強酸脫保護,Bum是目前很有發展前途的His側鏈保護基,其不足之處在于Fmoc(His)Bum在DCM和DMF中的溶解度較差.
7.5 Cys
Cys的-SH具有強親核性,易被酰化成硫醚,也易被氧化為二硫鍵,必須加以保護.常用保護基有三類:一類用TFA可脫除,如對甲芐基、對甲氧芐基和三苯甲基等;第二類可用(CF3CO)3T1/TFA脫除,對TFA穩定.如t-Bu、Bom和乙酰胺甲基等.第三類對弱酸穩定,如芐基和叔丁硫基(stBu)等,Cys(StBu)可用巰基試劑和磷試劑還原,Cys(Bzl)可用Na/NH3(1)脫保護.
7.6 Arg
Arg的胍基具有強親核性和堿性,必須加以保護.理想的情況是三個氮都加以保護,實際上保護1或2個胍基氮原子.保護基分四類:(1)硝基(2)烷氧羰基(3)磺酰基(4)三苯甲基.
硝基在制備、酰化裂解中產生很多副反應,應用不廣.烷氧羰基應主要有Boc和二金剛烷氧羰基(Adoc)2、Fmoc(Arg)Boc的耦聯反效率不高,哌啶理時不處穩定,會發生副反應;Adoc保護了兩個非π-N,但有同樣的副反應發生.對磺酰基保護,其中TOS應用最廣,但它較難脫除.近年來2,3,6-三甲基-4-甲氧苯橫酰基(Mtr)較受歡迎,在TFA作用下,30分鐘即可脫除,但是它們都不能完全抑制側鏈的酰化發生.三苯甲基保護基可用TFA脫除.缺點是反應較慢,側鏈仍有酰化反應,且其在DCM、DMF中溶解度不好.
7.7 Lys
Lys的ε-NH2必須加以保護.但與α-NH2的保護方式應不同,該保護基要到肽鏈合成后除去.ε-NH2的保護無消旋問題,可以采用酰基保護基,其它常用的保護基有芐氧碳基和Boc.

7.8 Fmoc基團的脫除
Fmoc基團的芴環系的吸電子作用使9-H具有酸性,易被較弱堿除去,反應條件很溫和.反應過程可表示如下:
哌啶進攻9-H,β消除形成二苯芴烯,很容易被二級環胺進攻形成穩定的加成物.Fmoc基團對不同的堿穩定性不同,可根據實際條件選用.
7.9 耦聯反應
固相中的接肽反應原理與液相中基本一致.將兩個相應的氨基被保護的及羧基被保護的氨基酸放在溶液內,并不形成肽鍵.要形成酰胺鍵,經常用的手段是將羧基活化,其方法是將它變成混合酸酐,或者將它變為活潑酯、酰氯,或者用強的失去劑(碳二亞胺)也可形成酰胺鍵,耦聯反應可表示如下:(A:羰基活潑試劑)
碳二亞胺是常用的活化試劑,其中Dcc使用范圍最廣,其缺點是形成了不溶于DCM的DCH,過濾時又難于除盡.其他一些如二異丙基碳二亞胺(DCI)、甲基叔丁基碳二亞胺也用于固相合成中,它們形成的脲
溶于DCM中,經洗滌可以除去.其他活化試劑,還有Bop(Bop-C1)、氯甲酸異丙酯、氯甲酸異丁酯、SOC12等.其中Dcc、Bop活化形成對稱酸酐、SOC12形成酰氯,其余三種形成不對稱酸酐.
7.10 對稱酸酐法
用Dcc形成對稱酸酐的方法使用較廣.其缺點是有些氨基酸在DCM中不易溶解,生成的Fmoc氨基酸酐溶解度更差.同時還有些副反應,如形成二肽、消旋等.
7.11 混合酸酐法
最常用試劑是氯甲酸的異丙基酯和異丁基酯.前者得到的酸酐穩定性好.只產生很少消旋,在適當的化學計量及溶劑條件下,耦聯反應很快.而且,在此反應中使用的N-甲基嗎啉和N-甲基哌啶對Fmoc基團無影響.
7.12 酰氯法
在Boc法中不常用的酰氯,因為比較激烈,一些保護基如Boc不穩定.但是,Fmoc基團可以耐受酰氯處理,生成的Fmoc氨基酰氯也很穩定.在三甲基乙酸/三胺或苯并三氮唑/二異丙基乙二胺中,反應速度很快,消旋很少.酰氯法在固相合成中應用還不多,但已表明,Fmoc-氨基酰氯適用于合成有立體障礙的肽序列.
7.13 活化酯法
活化酯法在固相合成中應用最為廣泛.采用過的試劑也很多,近來最常用的有HOBt酯、ODhbt酯、OTDO酯等.
HOBt酯反應快,消旋少,用碳二亞胺很容易制得;ODhbt酯很穩定,容易進行分離純化,與HOBt酯具有類似的反應性和消旋性能,它還有一個優越之處,在酰化時有亮黃色、耦聯結束時顏色消失,有利于監測反應;OTDO酯與ODhbt酯類似,消旋化極低,易分離,酰化時伴有顏色從桔紅色到黃色的變化等.
7.14 原位法
將碳二亞胺和α-N保護氨基酸直接加到樹脂中進行反應叫做原位法.
用DIC代替Dcc效果更好.其他的活化試劑還有Bop和Bop-C1等.原位法反應快、副反應少、易操作.其中DIC最有效,其次是Bop、Bop-C1等.遺憾的是Bop酰化時生成致癌的六甲基磷酰胺,限制了其應用.
7.15 裂解及側鏈保護基脫除
Fmoc法裂解和脫側鏈保護基時可采用弱酸.TFA為應用最廣泛的弱酸試劑,它可以脫除t-Bu、Boc、Adoc、Mtr等;條件溫和、副反應較少.不足之處:Arg側鏈的Mtr很難脫除,TFA用量較大;無法除掉Cys的t-Bu等基因.也有采用強酸脫保護的方法:如用HF來脫除一些對弱酸穩定的保護基,如Asp、Glu、Ser、Thr的Bzl(芐基)保護基等,但是當脫除Asp 的吸電子保護基時,會引起環化副反應.而TMSBr和TMSOTf在有苯甲硫醚存在時,脫保護速度很快.此外,根據條件不同,堿、光解、氟離子和氫解等脫保護方法也有應用.
Fmoc基團用于固相合成多肽已經有了十多年的歷史,在合成一些含有在酸性條件下不穩定的氨基的殘基的肽時,具有特別優越之處.將Fmoc法和Boc法互相補充,定會在合成更多、更大的生物分子中發揮.
 

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