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波泰客戶文章發表: Tumstatin肽對視網膜微血管內皮

發布者::admin   發布時間: :2012-04-25 09:58 瀏覽次數: :

tumstatin肽-由上海波泰生物科技有限公司提供合成??? www.jihjir.live?  

【摘要】?   目的:觀察tumstatin肽對體外培養的視網膜微血管內皮細胞遷移及P38MAPK蛋白表達的影響,初步探討tumstatin肽抗視網膜內皮細胞遷移的機制。方法:采用細胞劃痕實驗測定tumstatin肽(T8肽)對血管內皮生長因子(VEGF)誘導下RF/6A細胞(恒河猴視網膜微血管內皮細胞)遷移的影響;Western blotting檢測T8肽對VEGF刺激后15,30,45,60min的RF/6A細胞P38MAPK蛋白水平的變化。
結果:Tumstatin肽 (由上海波泰生物科技有限公司合成)對RF/6A細胞遷移具有抑制作用,且可抑制VEGF對RF/6A細胞的促遷移作用,呈劑量依賴性。正常情況下,RF/6A細胞無P38MAPK蛋白的表達,但VEGF可誘導其表達P38MAPK蛋白,而tumstatin可抑制VEGF誘導的RF/6A細胞P38MAPK蛋白的表達(加入20mg/L T8肽30,45,60min時蛋白表達受到顯著抑制,差異有顯著性意義,P<0.01)。結論:Tumstatin抑制視網膜微血管內皮細胞的遷移,其作用可能與P38MAPK通路有關。

【關鍵詞】? tumstatin;視網膜微血管內皮細胞;遷移;P38MAPK

  The effect of tumstatin peptide on the migration and expression of P38MAPK protein in retinal microvascular endothelial cells

  MinLi Huang, GuoRong Luo, WeiPing Chen, ShaoJian He, Fang Chen

  Foundation items: Guangxi Natural Science Foundation of China (No. 0640090); Ph.D. Candidate Research Innovation Fund of Guangxi Educational Department, China (No. 2006105981001D13)

  1Department of Ophthalmology,2 Department of Histology & Embryology, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

  Correspondence to: MinLi Huang. Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530021, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China. [email protected]

  AbstractAIM: To observe the effect of tumstatin peptide on the migration and expression of P38MAPK protein in retinal microvascular endothelial cells in vitro.
METHODS: Cell scratch healing assay was used to examine tumstatins interfering effect on the migration induced by vascular endothelial growth factor (VEGF) in RF/6A cells (cell line of retinal microvascular endothelial cell of Macaca rhesus). The expression of P38MAPK protein was examined by Western blotting test at 15, 30, 45 and 60 minutes after VEGF was stimulated by tumstatin peptide.
RESULTS: Tumstatin peptide can inhibit the migration of RF/6A cells directly and can also inhibit the upregulated migration of RF/6A cells induced by VEGF. It was in dosedependent manner. There was no expression of P38MAPK protein in RF/6A cells in normal conditions, and VEGF could stimulate RF/6A cells to express P38MAPK protein, but tumstatin can inhibit the expression of P38MAPK protein induced by VEGF in RF/6A cells. CONCLUSION: Tumstatin can inhibit the migration of retinal microvascular endothelial cells. The inhibitory effect may be related to the signal path through P38MAPK. P38MAPK is not the only pathway; the knob of inhibition may? be located in the upstream of P38MAPK.

KEYWORDS: tumstatin; retinal microvascular endothelial cells; migration; P38MAPK

  引言

??? 糖尿病性視網膜病變(diabetic retinopathy, DR)是較常見的致盲性眼病之一,其主要病變是視網膜新生血管形成。在新生血管形成過程中,血管內皮細胞遷移為較重要的環節之一,阻斷此過程的發生能有效地抑制新生血管生成[1,2]。Tumstatin是新近發現的血管形成抑制因子,對腫瘤新生血管形成具有明顯的抑制作用,且只作用于病理性的新生血管形成,而對發育和組織修復有關的新生血管形成無影響,是一種潛在的血管生成抑制劑,但其對視網膜微血管內皮細胞的作用尚未見報道[3]。本研究中,我們應用血管內皮生長因子(VEGF)誘導體外培養的視網膜微血管內皮細胞,而后應用tumstatin肽進行干預,采用細胞遷移試驗和Western blotting分別檢測細胞遷移和P38絲裂原激活蛋白激酶(P38MARK)蛋白表達的變化情況,試圖從VEGF受體細胞信號轉導通路角度初步探討tumstatin抗視網膜內皮細胞遷移的機制。

  1材料和方法

  1.1材料

  RF/6A細胞(恒河猴視網膜微血管內皮細胞)購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。RPMI 1640培養基(美國Gibco公司),TBD胎牛血清(天津灝洋生物公司),tumstatin肽(T8肽)(氨基酸序列為H KQRFTTMPFLFCNVND VCNFASRNDYSOH,純度高于96%,上海波泰生物科技有限公司合成),VEGF(以色列CytoLab Ltd),兔抗P38MAPK多克隆抗體(Cell signaling公司),辣根過氧化物酶(HRP)標記的人抗兔IgG(美國R&D公司),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)內參抗體(Santa Cruz公司),牛血清白蛋白(BSA)(美國Sigma公司),考馬斯亮藍(上海生物工程公司),化學發光底物系統(BeyoECL)(美國Pierce 公司),蛋白質Marker(預染)(含6條帶:118,86,47,34,26,19kDa)(美國MBI公司),硝酸纖維素膜(美國Millipore)。

  1.2方法

  1.2.1細胞遷移劃痕修復實驗

  實驗分為T0,T5,T10,T20組(各組培養基中T8肽的濃度分別為0,1,5,10,20,40mg/L)以及V+T0,V+T5,V+T10,V+T20組(各組中均含有0.01mg/L VEGF,T8肽的濃度分別為0,1,5,10,20,40mg/L)。每組設3個平行孔,以3×105/孔的密度接種RF/6A細胞于六孔細胞培養板,用含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養液培養。待細胞生長面積達90%后,改無血清的RPMI 1640培養液使細胞饑餓24h(使細胞基本同步化,在此期間處于非代謝狀態,細胞主要處于G0~G1期)。采用200μL Tip頭在孔中央對細胞作一個直的寬度約為0.8mm左右的劃痕。無血清培養液將刮掉的細胞沖洗干凈。沿劃痕邊緣等距離間隔作5個標記作為數據測定點,測量時取平均值。按分組加入實驗試劑,置于37℃,50mL/L二氧化碳飽和濕度的溫箱中繼續培養。培養0,24,48h后置10×5倍的倒置顯微鏡下拍照記錄。用病理圖像分析軟件測量各個時間點的劃痕兩側的細胞間距離(μm)變化,以0h劃痕邊沿的距離減去各個時間點遷移邊沿的距離來計算各個時間段視網膜微血管內皮細胞的遷移距離,反映細胞的遷移能力(圖1,遷移距離=CFDE)。

  1.2.2 Western blotting檢測P38MAPK蛋白表達

  實驗分為T0(培養基中加入PBS)、T20(培養基中加入20mg /L T8肽)、V(培養基中加入0.01mg/L VEGF)和T20+V組(培養基中加入20mg /L T8肽及0.01mg/L VEGF)。取對數生長期的RF/6A細胞,稀釋成1×109個/L,接種于50mm2的培養瓶中培養,每瓶5mL。待細胞貼壁后,按分組加入不同的培養液處理細胞15,30,45,60min。吸除培養液,PBS洗滌2次,加入預冷的細胞裂解液100μL,冰浴振蕩30min裂解,轉移至預冷的0.5mL離心管中,于4℃,12000g離心15min。上清液轉移至另一0.5mL離心管中,用考馬斯亮藍微盤比色法測定蛋白質含量。分裝,70℃貯存。檢測各組15,30,45,60min時P38MAPK蛋白表達量。實驗結果進行灰度值掃描分析,采用Bandscan5.0軟件統計吸光度值。

統計學處理:實驗結果以±s表示,差異顯著性采用方差分析(LSD法)或配對樣本的t檢驗,樣本均數間的兩兩比較采用StudentNewmanKeuls法,以P<0.05作為差異有統計學意義,統計分析采用SPSS10.0統計軟件完成。

  2 結果

  2.1 細胞遷移劃痕修復實驗

  與T0組比較,V+T0組中RF/6A細胞24,48h遷移的距離較大,差異有顯著性意義(P<0.01);與T0組比較,T5,T10,T20組RF/6A細胞24,48h遷移的距離顯著降低,且遷移距離隨著T8肽濃度的增大而逐漸降低,各組比較差異均有顯著性意義(P<0.01);與V+T0組相比,V+T5,V+T10,V+T20組RF/6A細胞24,48h遷移的距離顯著降低,且遷移距離隨著T8肽濃度的增大而逐漸降低,各組比較差異均有顯著性意義(P<0.01,表1)。表1 視網膜內皮細胞的遷移(略)

  2.2 Western blotting檢測P38MAPK蛋白表達

  在T0組和T20組中均未檢測到P38MAPK蛋白表達,而V組中加入VEGF刺激后,RF/6A細胞中P38MAPK被迅速激活,并持續升高,60min時蛋白表達量約為15min時的2倍(P<0.05)。與V組比較,T20+V組15min時P38MAPK蛋白表達量無顯著性差異(P>0.05),而30,45,60min時蛋白表達受到顯著抑制,差異有顯著性意義(P<0.01),30min時抑制率最大,為56.7%±1.7%(表2,圖2)。表2 各組細胞不同時間P38MAPK蛋白表達量的對比(略)

  3討論

??? 體外新生血管形成時,啟動血管生成的步驟中不僅包括內皮細胞的增殖,還包括內皮細胞的遷移。研究表明,在視網膜新生血管性疾病中,視網膜內由于缺氧等病理因素的刺激,血管形成刺激因子如血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子合成增加。這些因子刺激血管內皮細胞增生,而尿激酶型纖溶酶原激活基質金屬蛋白酶并使其合成增加,從而導致細胞外基質降解和內皮細胞發生遷移[46]。我們的研究結果也顯示,VEGF具有促進視網膜微血管內皮細胞遷移的作用,表現在V+T0組加入VEGF刺激后RF/6A細胞24,48h遷移距離顯著大于T0組。

Tumstatin是人類IV型膠原的α3鏈的非膠原結構域1(NC1)功能區,是最新發現的來源于人基底膜膠原的血管形成抑制因子,具有有效的抗新生血管活性。Tumstatin主要有3個活性片段:Tum 5(指接近N端的54~132位氨基酸序列片段)、T7肽(指接近N端的74~98位氨基酸大約25個氨基酸的片段)和T8肽(指接近N端的69~95位氨基酸大約25個氨基酸的片段),它們均具有與全長tumstatin同樣的抗新生血管活性[7,8]。Hutchings等[9]研究表明,人臍靜脈血管內皮細胞可以與培養皿中固定的VEGF的2種亞型VEGF165和VEGF189直接結合,這種結合受α3β1和αvβ3整合素調節,從而誘導內皮細胞的遷移和存活,而tumstatin能劑量依賴性地抑制VEGF與αvβ3整合素的結合,從而抑制內皮細胞的遷移;而抗αvβ3封閉性抗體可增強其抑制作用,提示VEGF與tumstatin競爭通過αvβ3的信號通路。在細胞遷移實驗中,我們發現,加入不同濃度的T8肽后,RF/6A視網膜微內皮細胞遷移距離顯著降低,說明tumstatin能抑制VEGF誘導的RF/6A細胞遷移,且成劑量依賴性。因此,我們認為,tumstatin抑制RF/6A視網膜內皮細胞遷移的作用可能也與tumstatin和VEGF競爭通過αvβ3的信號通路有關,具體機制需進一步研究闡明。

P38MAPK是由360個氨基酸組成的分子質量為38kDa的蛋白激酶,P38MAPK通路被稱為應激激活的促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路,主要增強細胞對應激原的抵抗力,并介導細胞凋亡的信號轉導,同時調控細胞遷移,與細胞的應激、凋亡和遷移有關。多種外界信號如紫外線、滲透壓、細胞因子、生理應激等均可激活P38MAPK,高血糖和糖尿病也可激活P38MAPK[10,11]。Wu 等[12]用20mg/L VEGF刺激人臍血管內皮細胞5min后,可以觀察到有P38MAPK的磷酸化。我們的研究結果也顯示,VEGF可以激活RF/6A細胞中的P38MAPK,表現在T0組未檢測到P38MAPK蛋白表達,而V組中加入VEGF刺激后,P38MAPK蛋白被迅速激活而表達增加,與文獻報道一致。我們推斷VEGF誘導視網膜微血管內皮細胞的遷移是通過激活P38MAPK信號通路。Rousseau等[13]發現,在原代培養的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)中,VEGF增強HUVEC細胞遷移,同時顯著誘導以張力絲形成和紐蛋白招募到黏著斑為特征的微絲網絡結構的重組;用P38MAPK特異性抑制劑SB203580抑制P38MAPK活性可抑制熱休克蛋白27(HSP27)磷酸化、肌動蛋白的重構和細胞遷移,而應用ERK激酶抑制劑PD98059抑制VEGF誘導的ERK激活后,肌動蛋白結構或細胞遷移并未受影響,提示P38MAPK途徑在調節內皮細胞遷移中發揮重要作用。Lamalice等[14]也證實了VEGF處理內皮細胞后觸發SAPK2/P38MAPK模塊的激活,從而促進彈性纖維形成和內皮細胞遷移。我們研究顯示,VEGF激活RF/6A細胞中的P38MAPK后,tumstatin可以顯著抑制P38MAPK蛋白的表達,表現在與V組比較,加入T8肽的T20+V組中P38MAPK蛋白的表達在各時段均有不同程度的下降。因此,我們推斷,當VEGF刺激引起VEGF受體(VEGFR)的活化,進而激活P38MAPK通路時,tumstatin可通過VEGFR信號轉導通路抑制P38MAPK,從而抑制視網膜微血管內皮細胞的遷移。

由于T0組和T20組中均未檢測到P38MAPK蛋白表達,而無VEGF存在的情況下,tumstatin也能抑制視網膜微血管內皮細胞的遷移,因此我們認為tumstatin雖可能通過VEGFR信號轉導通路抑制P38MAPK,進而抑制視網膜微血管內皮細胞的遷移,但P38MAPK可能并非抑制視網膜微血管內皮細胞遷移的唯一通路,或者P38MAPK也許只是抑制視網膜微血管內皮細胞遷移的下游通路,其抑制節點可能在P38MAPK的上游。

【參考文獻】
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  2 Feng X, Liu ZL. PEDF and Neovascularization Disease. Int J Ophthalmol
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  3 Maeshima Y, Sudhakar A, Lively JC, et al. Tumstatin, an endothelial cellspecific inhibitor of protein synthesis. Science2002;295(5552):140143

  4 Grant MB, Afzal A, Spoerri P, et al. The role of growth factors in the pathogenesis of diabetic retinopathy. Expert Opin Invest Drugs2004;13(10):12751293

  5劉正, 王業青, 張曉梅. 眼部新生血管與抗血管內皮生長因子治療. 國際眼科雜志 2007;7(3):779781

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  9 Hutchings H, Ortega N, Plouet J. Extracellular matrixbound vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell adhesion, migration, and survival through integrin ligation. FASEB J2003;17(11):15201522

  10秦建華, 陳明. P38絲裂原活化蛋白激酶與細胞遷移. 瀘州醫學院學報 2006;29(2):166168

  11朱艷軍, 李強, 陳波, 等. P38MAPK激活在高血糖致大鼠微血管通透性增高過程中的作用. 基礎醫學與臨床 2006;26(9):947951

  12 Wu G, Luo J, Rana JS, et al. Involvement of COX2 in VEGFinduced angiogenesis via P38 and JNK pathways in vascular endothelial cells. Cardiovasc Res2006; 69(2):512519

  13 Rousseau S, Houle F, Landry J, et al. p38 MAP kinase activation by vascular endothelial growth factor mediates actin reorganization and cell migration in human endothelial cells. Oncogene1997;15(18):21692177

  14 Lamalice L, Houle F, Huot J. Phosphorylation of Tyr1214 within VEGFR2 triggers the recruitment of Nck and activation of Fyn leading to SAPK2/p38 activation and endothelial cell migration in response to VEGF. J Biol Chem2006; 281(45):3400934020

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